Née à Lille en 1987, Anaïs Demoustier se passionne dès son plus jeune âge pour la comédie. C’est dans cette optique qu’à l’âge de sept ans, elle suit des cours de théâtre, lui permettant ainsi de se faire remarquer par une directrice de casting pour jouer un petit rôle dans Le Monde de Marty (1999), dans lequel elle donne la réplique à Michel Serrault. Fermement décidée à réitérer cette formidable expérience cinématographique, la petite lilloise décroche en 2003 son premier rôle important, dans Le Temps du loup, un drame familial mis en scène par Michael Haneke, avec Isabelle Huppert et Béatrice Dalle dans les rôles principaux.

Sa carrière lancée, elle enchaîne ensuite les seconds rôles dans divers films, tels le drame Barrage en 2006, les comédies Le Prix à payer (avec Christian Clavier et Nathalie Baye) et Hellphone en 2007, ou encore la comédie dramatique Les Murs porteurs en 2008 (avec Miou-Miou et Charles Berling). Avec La belle personne en 2008, la comédienne tourne sous la direction de Christophe Honoré et côtoie la nouvelle génération d’acteurs français (Louis Garrel, Léa Seydoux, Grégoire Leprince-Ringuet, etc.), avant de s'imposer l'année suivante dans Sois sage, dans la peau d'une jeune femme à la recherche de son amour perdu.

En 2009, lors de la 34e cérémonie des Césars, Anaïs Demoustier est nommée dans la catégorie Meilleur espoir féminin pour sa prestation dans la comédie dramatique Les Grandes Personnes, qui confirme son parcours prometteur. En 2010, l’actrice est à l’affiche de trois films dramatiques : elle prête ses traits à une gamine débrouillarde recueillie par Pascal Greggory et Ludmila Mikaël dans L' Enfance du mal d’Olivier Coussemacq ; joue une étudiante rencontrant un jeune homme vivant au jour le jour dans D'amour et d'eau fraîche d'Isabelle Czajka et se laisse à nouveau tenter par des marginaux dans Belle épine, aux côtés de Léa Seydoux qu'elle retrouve pour l'occasion.

Elle joue également au Théâtre dans Le Problème et est nominée au Molière 2011 du jeune talent féminin avec cette pièce.

En 2014 elle joue dans Le canard sauvage d'Hendrik Ibsen, m.e.s. Stéphane Braunschweig