Florence Thomassin fait ses débuts au cabaret music-hall l’Alcazar à Paris. Au cinéma, sa carrière est aujourd’hui déjà forte d’une trentaine de titres. Elle tourne notamment avec Guillaume Canet (Ne le dis à personne, 2006), Jean-Pierre Jeunet (Un long dimanche de fiançailles, 2004), Diane Kurys (L’Anniversaire, 2005), Édouard Molinaro (Beaumarchais, 1996) ou Bernard Rapp (Une affaire de goût, 2000, qui lui vaut une nomination du meilleur second rôle féminin aux Césars 2001), mais aussi avec Stéphane Allagnon, Nicolas Boukhrief, Antony Cordier, Lionel Delplanque, Martine Dugowson, Marc Esposito, Henri Herre, Jan Kounen, Gérard Mordillat, Jean-Daniel Verhaeghe, Marion Vernoux, Laurence Ferreira-Barbosa, Pascal Elbé, de Jean-François Richet (Mesrine : l’instinct de mort), Bertrand Tavernier (La Princesse de Montpensier).

Dernièrement, on a pu la voir dans Comme des frères d’Hugo Gélin (2012), Douze ans d’âge (juin 2013), et Le Coeur des hommes (octobre 2013).

Elle est à l'affiche en 2014 d'Ablations d'Arnold De Parscau, et dans Les Nuits d'été de Mario Fanfani.

Florence Thomassin, qui tourne également dans près d’une trentaine de téléfilms, fait ses débuts au théâtre en 2003, dans Providence Café, de Mohamed Rouabhi dans une mise en scène de l’auteur, avant d’interpréter un rôle dans Et après…, de Barbara d’Alessandrini et Héléna Noguerra dans une mise en scène de Barbara d’Alessandri et Dominique Farrugia en 2006.

Plus récemment, elle était Stella dans Un tramway mis en scène par Krzysztof Warlikowski à l’Odéon-Théâtre de l’Europe (2010 et 2012, tournée internationale pendant trois ans).

Elle est également sculptrice.